滨蒿内酯通过调节EGFR/MAPK通路诱导卵巢癌细胞凋亡

吕芳麟，张熠**

（苏州大学药学院，苏州，215123）

2.0 College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University；College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University苏州大学药学院，苏州，215123;苏州大学药学院，苏州，215123215123;21512317865569819;1386216747617865569819;65208583苏州大学独墅湖校区南区;苏州大学独墅湖校区南区云轩楼627395221@qq.com;zhangyi@suda.edu.cn吕芳麟，女，肿瘤药理学;张熠，男，博导，肿瘤药理学吕芳麟;张熠LV Fanglin;ZHANG Yi张熠2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*J. L. Tang, B. Y. Liu,K. W. Ma, Lancet 2008,372,1938-1940.<CR>2*|*期刊*|*F. Tao, S. Ruan, W. Liu, L. Wang, Y. Xiong, M. Shen, PloS one 2016,11,e0168892.<CR>3*|*期刊*|*L. Wu, C. Qian, W. Zhang, M. Shi, X. Chen, Y. Wang, F. Lin, Phytomedicine 2023,116,154846.<CR>4*|*期刊*|*C. Wu, T. Li, B. Zhu, R. Zhu, Y. Zhang, F. Xing, Y. Chen, RSC Adv 2019,9,2302-2308.<CR>5*|*期刊*|*W. D. Feng, Y. Wang, T. Luo, X. Jia, C. Q. Cheng, H. J. Wang, M. Q. Zhang, Q. Q. Li, X. J. Wang, Y. Y. Li, J. Y. Wang, G. R. Huang, T. Wang, A. L. Xu, Acta Pharmacol Sin 2023,44,1238-1251.<CR>6*|*期刊*|*Y. Yao, F. Xu, X. Ju, Z. Li,L. Wang, J Agric Food Chem 2020,68,4205-4214.<CR>7*|*期刊*|*J. K. Kim, J. Y. Kim, H. J. Kim, K. G. Park, R. A. Harris, W. J. Cho, J. T. Lee, I. K. Lee, PloS one 2013,8,e80391.<CR>8*|*期刊*|*M. Kielbus, K. Skalicka-Wozniak, A. Grabarska, W. Jeleniewicz, M. Dmoszynska-Graniczka, A. Marston, K. Polberg, P. Gawda, J. Klatka, A. Stepulak, Anticancer Res 2013,33,4347-4356.<CR>9*|*期刊*|*G. Bethune, D. Bethune, N. Ridgway,Z. Xu, J Thorac Dis 2010,2,48-51.<CR>10*|*期刊*|*R. Roskoski, Jr., Pharmacol Res 2019,139,395-411.<CR>11*|*期刊*|*Y. H. Chiou, S. H. Liou, R. H. Wong, C. Y. Chen,H. Lee, Toxicol Lett 2015,237,46-54.<CR>12*|*期刊*|*Y. Liang, T. Zhang,J. Zhang, Pharmacol Res 2020,161,105164.<CR>13*|*期刊*|*D. Tang, C. Y. Liu, D. Shen, S. Fan, X. Su, P. Ye, P. R. Gavine, X. Yin, Onco Targets Ther 2015,8,7-14.<CR>14*|*期刊*|*M. Scartozzi, I. Bearzi, R. Berardi, A. Mandolesi, C. Pierantoni, S. Cascinu, British journal of cancer 2007,97,92-97.<CR>15*|*期刊*|*J. Xu, Y. Du, X. J. Liu, B. Y. Zhu, S. H. Zhang, L. Li, Y. Li, X. F. Wang, C. K. Shan, R. Q. Wang, Y. S. Zhen, Pharmacol Res 2017,126,66-76.<CR>16*|*期刊*|*P. C. Tsai, C. Y. Hsieh, C. C. Chiu, C. K. Wang, L. S. Chang, S. R. Lin, Toxicon 2012,60,734-743.<CR>17*|*期刊*|*T. Zhang, Y. Liang,J. Zhang, Pharmacol Res 2020,156,104802.<CR>18*|*期刊*|*Y. Yarden, Eur J Cancer 2001,37 Suppl 4,S3-8.<CR>19*|*期刊*|*B. Bodey, H. E. Kaiser,S. E. Siegel, In Vivo 2005,19,931-941.<CR>20*|*期刊*|*T. Zhang, S. Zhong, Y. Wang, S. Dong, T. Guan, L. Hou, X. Xing, J. Zhang, T. Li, Food Chem 2019,270,281-286.<CR>21*|*期刊*|*F. Ciardiello,G. Tortora, Eur J Cancer 2003,39,1348-1354.<CR>22*|*期刊*|*A. Becker, L. Crombag, D. A. Heideman, F. B. Thunnissen, A. W. Van Wijk, P. E. Postmus, E. F. Smit, Eur J Cancer 2011,47,2603-2606.<CR>23*|*期刊*|*T. Zhang, Y. Liang, P. Zuo, M. Yan, S. Jing, T. Li, Y. Wang, J. Zhang, Z. Wei, Food Chem Toxicol 2019,131,110642.<CR>24*|*期刊*|*Y. Lin, X. Wang,H. Jin, Am J Cancer Res 2014,4,411-435.<CR>25*|*期刊*|*S. A. Welch,M. J. Moore, Future Oncol 2007,3,247-254.滨蒿内酯通过调节EGFR/MAPK通路诱导卵巢癌细胞凋亡|Scoparone induces ovarian cancer cell apoptosis induces apoptosis||1|吕芳麟|LV Fanglin|苏州大学药学院，苏州，215123|College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University|吕芳麟，女，肿瘤药理学|苏州大学独墅湖校区南区|215123|627395221@qq.com|17865569819|17865569819<CR>*|2|张熠|ZHANG Yi|苏州大学药学院，苏州，215123|College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University|张熠，男，博导，肿瘤药理学|苏州大学独墅湖校区南区云轩楼|215123|zhangyi@suda.edu.cn|65208583|13862167476

摘要：目的：探究滨蒿内酯对卵巢癌细胞功能的影响。方法：分别通过MTT、克隆集落检测滨蒿内酯对卵巢癌细胞系增殖能力的影响，利用划痕、Transwell侵袭实验检测滨蒿内酯对卵巢癌细胞系迁移侵袭能力的影响，通过WB、流式细胞术评估滨蒿内酯处理后卵巢癌细胞的凋亡水平，利用在线网站Swiss预测滨蒿内酯潜在结合蛋白，通过GO和KEGG分析富集蛋白通路，利用WB技术检验滨蒿内酯结合蛋白预测结果。结果：MTT和克隆集落结果显示滨蒿内酯有效抑制卵巢癌细胞的增殖能力，划痕和侵袭实验结果表明滨蒿内酯显著抑制卵巢癌的迁移和侵袭能力，WB和流式细胞结果显示，滨蒿内酯能够有效促进卵巢癌细胞的凋亡水平，并且Swiss在线分析网站显示滨蒿内酯潜在结合蛋白与凋亡信号通路重叠，经过WB检验，滨蒿内酯调控EGFR/MAPK信号通路。结论：滨蒿内酯显著抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭水平，并且通过EGFR/MAPK信号通路促进卵巢癌细胞的凋亡。

关键词：肿瘤药理学；滨蒿内酯；卵巢癌；凋亡。

中图分类号：R96

Scoparone induces ovarian cancer cell apoptosis induces apoptosis

LV Fanglin, ZHANG Yi

(College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University)

Abstract: Objective: To investigate the effects of scoparone on the functions of ovarian cancer cells. Methods: MTT and colony formation assays were used to examine the effects of scoparone on the proliferation ability of ovarian cancer cell lines. Scratch wound healing assay and Transwell invasion assay were performed to detect the effects of scoparone on the migration and invasion abilities of ovarian cancer cell lines. Western blot (WB) and flow cytometry were employed to evaluate the apoptosis level of ovarian cancer cells after scoparone treatment. The Swiss online website was used to predict the potential binding proteins of scoparone, and Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyses were conducted to enrich protein pathways. The predicted results of scoparone-binding proteins were verified by WB technology. Results: MTT and colony formation assays revealed that scoparone effectively inhibited the proliferation ability of ovarian cancer cells. Scratch wound healing and invasion assays showed that scoparone significantly suppressed the migration and invasion abilities of ovarian cancer. WB and flow cytometry results indicated that scoparone effectively promoted the apoptosis level of ovarian cancer cells. The Swiss online analysis website revealed that the potential binding proteins of scoparone overlapped with the apoptosis signaling pathway. After WB verification, scoparone regulated the EGFR/MAPK signaling pathway. Conclusion: Scoparone significantly inhibits the proliferation, migration, and invasion levels of ovarian cancer cells and promotes apoptosis through the EGFR/MAPK signaling pathway.

Key words: Tumor Pharmacology; Scoparone; Ovarian Cancer; Apoptosis

引言

在癌症治疗领域，传统中药(Traditional Chinese medicine, TCM)不仅展现出独特的预防和治疗能力，而且显著地减少了化疗的副作用，为患者带来了新的希望[1]。中药的抗癌作用在卵巢癌中已经得到验证。例如，茯苓可以抑制卵巢癌的细胞增殖以及TGFβ1诱导的EMT，抑制体内肿瘤的生长与转移[2]。银杏叶的提取物-银杏素（原为“银杏叶的提取物银杏素”）被报道能通过抑制JAK/ATAT3信号通路抑制卵巢癌的生长[3]；因此，中药也可以改善癌症患者的生活质量。滨蒿内酯（scoparone, SCO）是中药茵陈蒿的主要成分；该成分具有抗氧化、降脂和抗炎作用，其抗癌潜力亦逐渐受到科学界的关注[4-6]，已在多项研究中显示出对癌症细胞的显著抑制作用。（将原文两句进行合并）例如，SCO 通过抑制信号转导子和转录激活子的活性，显示出显著的抗前列腺癌细胞作用（原文为“对前列腺癌细胞显示出显着的抗肿瘤作用”）[7]。 SCO 以剂量依赖性方式减少喉癌细胞的迁移并诱导其凋亡[8]。然而，SCO在卵巢癌治疗中的潜在作用尚未得到系统研究。

肿瘤的恶性进展与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）的异常活跃密切相关。EGFR属于 erbB 家族，该家族由四种密切相关的受体酪氨酸激酶组成：erbB1（也称为 EGFR）、erbB2、erbB3 和 erbB4[9,10]。所有 erbB 家族蛋白都是跨膜受体酪氨酸激酶，由三个功能区组成，分别为胞外配体结合区、具有单个疏水锚定序列的跨膜区和胞内酪氨酸激酶区[11-13]。与特定配体表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）的结合导致EGFR二聚化，从而引发不同的细胞内信号传导途径级联反应[14,15]。在EGFR下游，有两条主要信号通路，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）/AKT（protein kinase B, AKT）和Ras（renin-angiotensin system，）/MEK（MAP kinase-ERK kinase）/ERK（Extracellular regulated protein kinases）[16,17]。众所周知，EGFR 在细胞迁移、凋亡和增殖中发挥着至关重要的作用[17,18]。 EGFR 信号通路的过度激活已被证明是多种恶性肿瘤发病机制和进展的重要一步[19,20]。同时，观察到EGFR在许多实体瘤中过度表达或失调，并在抗癌治疗的临床试验中被证实为有效靶点[21]。因此，EGFR的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors, TKI）在全球范围内被批准用于治疗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[22,23]。第一代EGFR TKI，如厄洛替尼和吉非替尼，旨在可逆地竞争ATP结合位点，从而阻断EGFR下游信号通路的激活[12,24]。然而，合成的EGFR或TKI在临床使用时，通常导致例如腹泻和丘疹脓疱性皮疹的副作用[25]。

因此，本研究以卵巢癌与SCO为研究焦点，深入探索SCO对卵巢癌的抗癌机制，特别是其对EGFR/MAPK信号通路的调控作用。本研究不仅旨在为卵巢癌的治疗提供新的策略，也为中药在癌症治疗中的应用提供坚实的理论支撑，为未来开发新型、低副作用的EGFR抑制剂开辟新途径。

材料与方法

细胞培养

实验所用人卵巢癌细胞系COV362细胞株和人卵巢癌细胞系ES-2细胞株均采购于ATCC。其中COV362在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（双抗）溶液的1640培养基中生长；ES-2在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（双抗）溶液的McCoy’s 5A培养基中培养。上述细胞均处于37℃、5%CO2的恒温状态下生长，每天显微镜下观察其生长状态。待其生长至90%的密度时按照1:3或1:4比例进行细胞传代。

MTT细胞活力评估

将细胞按照3000~5000个/孔的密度铺设至96孔板中，待其贴壁24 h后，按照实验设计要求，更换为对应培养基配制对应浓度的SCO溶液，以每孔100 μL体积加入96孔板中。处理相应时长后，更换MTT工作溶液（1mg/mL MTT溶液:完全培养基=1:1），以每孔30 μL加入96孔板中，避光37℃反应3 h后，加入100 μL/孔的DMSO，水平80rpm摇床反应30 min后，使用酶标仪测量490 nm处各组的吸光值，并根据此计算细胞活力。

克隆集落实验

取生长至50%~60%的细胞弃去上清，加入对应条件下的培养基处理48 h后，消化、计数，按照每组3个复孔，每孔800个细胞计算所需细胞总数。将对应数量的细胞重悬液均匀铺至6孔板中，放置于37℃培养箱中生长，期间每隔3天更换一次新鲜培养基。待细胞集落生长至肉眼可见大小（约14天），弃去原培，PBS清洗2次后，加入4%多聚甲醛固定30 min后，再PBS清洗2次，每孔加入500 μL结晶紫溶液染色30 min后，PBS清洗至背景澄清透明，自然光下拍照记录。

细胞划痕实验

待细胞生长至80%~90%时，利用200 μL枪尖在孔板内画“井”字。弃去上清与脱落的细胞，再用PBS小心清洗2次后，加入对应浓度SCO的完全培养基培养48 h，期间分别于0 h，24 h和48 h对固定划痕处进行显微镜成像记录，后续利用imagine J软件处理划痕结果。

Transwell实验

取生长密度为80%~90%密度的细胞进行消化、计数，用对应浓度的SCO基础培养基重悬细胞密度至20万/mL，以100 μL的体积均匀铺至8 μm的Transwell小室中，并向下室中加入对应浓度SCO的完全培养基，37℃培养24 h。24 h结束后，取出小室用PBS小心清洗小室内部、外部，小室底部切勿直冲以防细胞脱落。将小室底部浸泡在4%多聚甲醛溶液中30min，PBS清洗2次，将小室浸泡在结晶紫溶液中染色30 min，用PBS小心清洗4~5次，用尖头棉签小心擦拭小室内部膜面，擦去未穿透的细胞。

流式细胞实验

在药物处理结束后，收集细胞以及其培养基上清，经1000 rpm离心5 min进行富集，加入4 mL PBS重悬细胞，计数，取10 万细胞再次离心富集，弃上清，用192 μL Annexin V-FITC结合液均匀重悬细胞，再加入5 μL碘化丙啶染色液，吹打混匀，室温避光孵育20 min，随后置于冰浴中，待流式细胞仪上机检测。

Western blotting实验

提取蛋白样品

在药物处理结束后，将细胞培养皿置于冰块上，弃上清，使用预冷的PBS清洗2次，加入RIPA细胞裂解液摇晃裂解3 min，细胞刮棒刮下细胞并转移至离心管中，冰浴15 min，期间预冷高速离心机至4℃，12000 rpm离心10 min，取上清至新离心管中并记录下体积V，使用BSA试剂盒测定蛋白浓度。加入1/5体积V的6×Loading Buffer，混悬均匀后沸水浴蛋白变性10 min，保存于-20℃中用于后续实验。

SDS-PAGE凝胶电泳

配胶：根据目的蛋白分子量配制相应浓度的分离胶，注入提前准备好的干净制胶玻璃板中，到合适高度后加入无水乙醇液封，等待30~60 min待其凝固。倒净无水乙醇并用滤纸吸尽残余液体，配制所需体积的浓缩胶，插入梳子静置凝固30 min。

电泳：配制新鲜的1×running buffer注入胶板之间以及电泳槽中，拔掉梳子按照实验设计依次上样，并使用1×Loading Buffer对上样体积进行配平。设置80 V恒压电泳30 min，再120 V恒压电泳45~60 min待溴酚蓝距离胶板底部约1~2 cm时停止电泳。

转膜：将电泳凝胶转移至浸泡在1×Trans Buffer的三明治结构的转膜夹中，按照黑-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜（需甲醇活化）-滤纸-海绵-透明顺序进行转膜，黑对黑。向转膜槽中放入冰盒，转膜槽置于冰水混合物中，在300 mA恒流下转膜90 min，根据分子量大小可适当延长转膜时间，但转膜温度需控制在4℃左右。

封闭：使用TBST配制的5%脱脂牛奶对转膜结束的PVDF膜进行封闭，室温50~60 rpm摇床封闭90 min。

敷一抗：封闭结束后，使用TBST摇床100 rmp清洗3次，每次10 min。按照抗体说明书稀释对应抗体，裁剪下相应位置的目的条带，4℃孵育过夜。

敷二抗：回收一抗，使用TBST摇床100 rmp清洗3次，每次10 min。根据一抗种属配置同源二抗，根据二抗说明书稀释对应为浓度，室温摇床50 rpm孵育90 min。使用对应二抗的显影仪对条带进行发光成像。

统计学分析

采用GraphPad Prism 9软件对实验结果进行统计分析并制作图表。所有实验数据以均值±标准误表示，两组间分析采用Student’s t-test进行统计分析，多组间分析采用方差分析，其中*P<0.05 表示差异具有统计学意义，**P<0.01 表示差异具有显著性统计学意义。

结果

滨蒿内酯对卵巢癌的细胞毒性

总体而言，滨蒿内酯对卵巢癌细胞系COV362和ES-2的细胞活力展现出了显著的时间和剂量依赖性的抑制效应。具体而言，如图1A中所示，对于COV362细胞，随着处理时间的延长（24小时、48小时、72小时），滨蒿内酯的IC50值逐渐降低，分别为1483.84±2.84 μM、938.97±1.74 μM、416.74±1.37 μM，表明其对细胞活力的抑制作用随时间增强。而对于ES-2细胞（图1B），同样观察到类似的趋势，IC50值在24小时、48小时、72小时分别为1638.93±2.74 μM、996.53±1.63 μM、583.53±0.35 μM。值得注意的是，当滨蒿内酯的剂量达到1000 μM时，两种细胞系在24小时处理后均表现出显著的细胞活力下降。

在250 μM的低剂量下，两种细胞系在处理72小时后依然保持了60%以上的细胞活力，这为我们后续的实验提供了合适的浓度梯度选择依据。因此，我们设定了低（250 μM）、中（500 μM）、高（1000 μM）三个浓度梯度，以深入探究滨蒿内酯抑制卵巢癌细胞活力的最佳作用浓度及其分子机制。

为了评估滨蒿内酯对卵巢癌细胞长期增殖能力的影响，我们进行了克隆集落实验。结果显示，随着滨蒿内酯浓度的增加，卵巢癌细胞克隆集落的形成受到不同程度的抑制（图1.C-F）。特别地，与ES-2细胞系相比，滨蒿内酯对COV362 细胞系的抑制效应更为显著（原文为“COV362 细胞系对滨蒿内酯的抑制效应更为敏感”）（图1.C-D），在500 μM的剂量下，ES-2细胞的集落形成能力虽然受到显著抑制（图1.E-F），但COV362细胞系受到的抑制程度更为显著。（原文为“但COV362 细胞系的抑制程度更为显著。”）

图1 滨蒿内酯抑制卵巢癌细胞的增殖。 A. MTT法检测COV362细胞分别在DMSO，125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯浓度下处理24 h、48 h、72 h。B. MTT法检测ES-2细胞分别在DMSO，125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯浓度下处理24 h、48 h、72 h。C. COV362分别在DMSO，125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯浓度下处理48 h，克隆集落培养14天。D. COV362克隆集落统计图。E. ES-2分别在DMSO，125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯浓度下处理48 h，克隆集落培养14天。F. ES-2克隆集落统计图

滨蒿内酯抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭

在癌症的恶性进展过程中，癌细胞的迁移和侵袭能力起着至关重要的作用。为了深入探索滨蒿内酯对卵巢癌细胞这些恶性行为的影响，我们进行了对细胞迁移和侵袭能力实验评估。通过划痕实验，我们观察到滨蒿内酯对COV362和ES-2两种卵巢癌细胞系的迁移能力具有显著的抑制作用。与DMSO处理组相比，滨蒿内酯以浓度依赖的方式抑制了这两种细胞的迁移能力。特别是当滨蒿内酯的浓度达到或超过500 μM时，其抑制效果尤为显著（图2.A-D）。

进一步的侵袭实验结果显示，滨蒿内酯在较高浓度下（500 μM和1000 μM）对COV362和ES-2细胞的侵袭能力产生了明显的抑制效果（图2.E-H）。这一发现表明，滨蒿内酯在调控卵巢癌细胞迁移和侵袭方面展现出了潜在的应用前景，为卵巢癌的治疗提供了新的策略和方向。

图2 滨蒿内酯抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭。 A. COV362细胞经划痕处理后分别在DMSO、125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯处理48 h后。B. COV362划痕愈合统计图。C. ES-2细胞经划痕处理后分别在DMSO、125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯处理48 h后。D. ES-2划痕愈合统计图。E. COV362细胞分别在DMSO、125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯处理下Transwell侵袭结果图。F. COV362侵袭实验统计图。G. ES-2细胞分别在DMSO、125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯处理下Transwell侵袭结果图。H. ES-2侵袭实验统计图。

滨蒿内酯促进卵巢癌细胞的凋亡

在进一步的研究中，我们对滨蒿内酯在不同浓度下对卵巢癌细胞凋亡程度的影响进行了深入评估。通过运用蛋白印迹检测技术，我们检测了低、中、高三种不同浓度下COV362细胞中的凋亡蛋白标志物（图3.A）。实验数据显示，在滨蒿内酯浓度为500 μM时，细胞中的关键凋亡蛋白cleaved-PARP和cleaved-caspase-3的表达水平显著上升（图3.B-C），这意味着此时细胞的凋亡活动的增强。

进一步地通过流式细胞术的分析，我们观察到滨蒿内酯诱导的凋亡在COV362细胞中具有明显的剂量依赖性。具体来说，随着滨蒿内酯浓度的递增，凋亡细胞的占比也呈现逐步上升的趋势（图3.D-E）。值得注意的是，即使在250 μM的浓度下，虽然通过蛋白印迹技术检测到的凋亡蛋白水平尚未出现显著变化，但流式细胞术的结果已经显示出细胞开始发生轻度的凋亡。

图3 滨蒿内酯诱导卵巢癌细胞的凋亡。 A. 蛋白印迹检测COV362细胞分别在DMSO、125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯处理48 h后cleaved-PARP和cleaved-caspase-3的蛋白水平，β-actin为内参蛋白。B. 为COV362细胞的cleaved-PARP蛋白表达统计图。C. 为COV362细胞的cleaved-caspase-3蛋白表达统计图。D. 流式细胞术检测COV362细胞分别在DMSO、125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯处理48 h后细胞凋亡情况。E. COV362流式检测凋亡统计图。

EGRK/MAPK是滨蒿内酯的潜在结合靶点

为了更深入地探究滨蒿内酯在抑制肿瘤细胞生长方面的分子机制，我们采用了在线工具对滨蒿内酯的潜在结合蛋白进行了预测。基于滨蒿内酯的特定分子结构（图4.A），我们成功识别了一系列潜在的结合蛋白。进一步通过GO富集分析，我们发现这些结合蛋白在凋亡相关的生物过程中显著富集（图4.B），且特别在丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性通路上高度富集（图4.C）。这一激酶家族涵盖了众多关键蛋白，其中包括BRAF和MAPK等被识别为滨蒿内酯的潜在结合蛋白，并且它们还是ERK/MAPK凋亡通路中的核心信号分子。

值得注意的是，表皮生长因子受体（EGFR）在滨蒿内酯潜在结合蛋白的预测中位列前茅（图4.D），该受体是ERK/MAPK通路中至关重要的上游调控因子。鉴于EGFR/MAPK信号通路在细胞活动中扮演着举足轻重的角色，尤其是在细胞凋亡的调控中发挥着关键作用，我们决定进一步验证滨蒿内酯是否通过靶向这一信号通路来介导卵巢癌细胞的凋亡。

图4 滨蒿内酯潜在结合蛋白。 A. 滨蒿内酯分子结构式B. 滨蒿内酯潜在结合蛋白GO富集ColorByCluster分析。C. 滨蒿内酯潜在结合蛋白GO富集信号通路分析。D. 滨蒿内酯潜在结合排名前列的蛋白。

滨蒿内酯抑制EGRK/MAPK信号通路的激活

蛋白印迹的结果显示，EGFR/MAPK信号通路中的关键蛋白均受到了滨蒿内酯的显著影响。其中EGFR的磷酸化蛋白水平以剂量依赖的方式受到抑制，而MEK1/2的磷酸化水平也呈现出剂量依赖性的下降趋势。进一步分析发现，在250 μM的滨蒿内酯处理下，COV362细胞中的磷酸化BRAF水平显著降低；而当滨蒿内酯的浓度增加至500 μM时，ERK1/2的磷酸化水平也呈现出了明显的下降。

这些发现进一步证实了滨蒿内酯对EGFR和BRAF这两种潜在结合蛋白的显著影响。滨蒿内酯通过与EGFR和BRAF的相互作用，影响了它们对应的磷酸化蛋白水平，从而抑制了EGFR/MAPK信号通路的激活。这一作用机制对于促进卵巢癌细胞的凋亡具有潜在的重要意义。

图5 滨蒿内酯抑制COV362细胞中的EGRK/MAPK信号通路。 A. 蛋白印迹检测COV362细胞分别在DMSO、125 μM、250 μM、500 μM和1000 μM的滨蒿内酯处理48 h后EGFR、p-EGFR、BRAF、p- BRAF、MEK1/2、p- MEK1/2、ERK1/2、p- ERK1/2的蛋白水平，β-actin为内参蛋白。B. 为COV362细胞的p-EGFR蛋白表达统计图。C. 为COV362细胞的p- BRAF蛋白表达统计图。D. 为COV362细胞的p- MEK1/2蛋白表达统计图。E. 为COV362细胞的p- ERK1/2蛋白表达统计图。

结论

本研究对滨蒿内酯在卵巢癌细胞系COV362和ES-2中的生物活性进行了全面的评估。实验结果表明，滨蒿内酯对这两种卵巢癌细胞的细胞活力具有显著的时间和剂量依赖性的抑制效应。特别是在长时间（72小时）的处理下，滨蒿内酯的IC50值明显降低，显示出其强大的抗肿瘤潜力。通过克隆集落实验，我们进一步证实了滨蒿内酯对卵巢癌细胞长期增殖能力的显著抑制作用，尤其在COV362细胞系中表现更为敏感（图1）。

此外，滨蒿内酯还能有效抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力，这对于防止癌症的恶性进展具有重要意义。划痕实验和侵袭实验的结果均显示，滨蒿内酯以浓度依赖的方式抑制了卵巢癌细胞的迁移和侵袭（图2）。

在细胞凋亡方面，滨蒿内酯也展现出了显著的效果。通过蛋白印迹检测技术和流式细胞术的分析，我们发现滨蒿内酯能够促进卵巢癌细胞的凋亡，并且这一过程具有剂量依赖性。特别地，当滨蒿内酯浓度达到500 μM时，凋亡蛋白标志物cleaved-PARP和cleaved-caspase-3的表达水平显著上升，凋亡细胞的占比也显著增加（图3）。

为了深入探究滨蒿内酯的抗肿瘤机制，我们利用在线工具预测了滨蒿内酯的潜在结合蛋白，并通过GO富集分析发现这些蛋白与凋亡相关的生物过程显著相关，特别是在丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性通路上高度富集。其中，EGFR作为ERK/MAPK通路中的关键上游调控因子，被预测为滨蒿内酯的潜在结合蛋白之一（图4）。

进一步通过蛋白印迹技术，我们证实了滨蒿内酯能够显著抑制EGFR/MAPK信号通路中关键蛋白的磷酸化水平，包括EGFR、MEK1/2、BRAF和ERK1/2。这些发现表明，滨蒿内酯通过结合并抑制EGFR/MAPK信号通路中的关键蛋白，进而抑制了该通路的激活，促进了卵巢癌细胞的凋亡（图5）。

综上所述，滨蒿内酯在卵巢癌细胞系COV362和ES-2中展现出了显著的抗肿瘤活性，包括抑制细胞活力、迁移和侵袭能力，以及促进细胞凋亡。其潜在的作用机制可能与抑制EGFR/MAPK信号通路的激活有关。因此，滨蒿内酯有望成为一种新的卵巢癌治疗候选药物，值得进一步的研究和开发。

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作者简介：吕芳麟，女，肿瘤药理学

通信联系人：张熠，男，博导，肿瘤药理学. E-mail: zhangyi@suda.edu.cn