核糖体合成和翻译后修饰肽graspetide类天然产物的研究进展

林思行，虞沂，张倩**

（武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,武汉 430072）

2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Ministry of Education),School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072；Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Ministry of Education),School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072；Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Ministry of Education),School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,武汉 430072;武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,武汉 430072;武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,武汉 430072430072;430072;43007213640329460;13871417151;1354538957613640329460;13871417151;13545389576武汉大学测试中心C506;武汉大学测试中心A407;武汉大学测试中心C-506lsx13640329460@163.com;yu_yi@whu.edu.cn;qianz@whu.edu.cn林思行（1997），男，硕士研究生，主要研究方向是微生物天然产物的生物合成;虞沂（1978），男，教授、博导，主要研究方向是天然产物生物合成;张倩（1994），女，助理研究员，主要研究方向是天然产物生物合成林思行;虞沂;张倩Lin Sixing;YU Yi;Zhang Qian张倩 2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*Martens E, Demain A L. 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Nature Chemistry, 2022,14(11):1325-1334.核糖体合成和翻译后修饰肽graspetide类天然产物的研究进展|Research progress on graspetide-like ribosomally synthesized and post-translationally modification peptide kind natural products||1|林思行|Lin Sixing|武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,武汉 430072|Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Ministry of Education),School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072|林思行（1997），男，硕士研究生，主要研究方向是微生物天然产物的生物合成|武汉大学测试中心C506|430072|lsx13640329460@163.com|13640329460|13640329460<CR>|2|虞沂|YU Yi|武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,武汉 430072|Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Ministry of Education),School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072|虞沂（1978），男，教授、博导，主要研究方向是天然产物生物合成|武汉大学测试中心A407|430072|yu_yi@whu.edu.cn|13871417151|13871417151<CR>*|3|张倩|Zhang Qian|武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室,武汉 430072|Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Ministry of Education),School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072|张倩（1994），女，助理研究员，主要研究方向是天然产物生物合成|武汉大学测试中心C-506|430072|qianz@whu.edu.cn|13545389576|13545389576

摘要：微生物天然产物是抗生素的重要来源，通过改造天然产物生物合成途径来研发具有优良药理活性衍生物一直是对抗细菌耐药性的重要手段。核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs）是一大类具有潜在抗生素活性的微生物天然产物，与非核糖体肽类和聚酮合酶类天然产物相比，参与RiPPs生物合成的后修饰酶具有更大的底物宽泛性，这也使得RiPP天然产物具有更大的改造潜力。目前已发现的RiPPs多达三十余种，且呈现出抗菌、抗肿瘤等多种生物活性。Graspetides是一类具有大环化修饰的RiPPs，该结构特征赋予了graspetides良好的膜渗透性和稳定性，使其在药物开发中具有显著优势。依据前体肽的保守序列和后修饰酶的类别，graspetides可分为超过24组，暗示其生物组装逻辑复杂多变。本文综述了近年来新发现的代表性graspetides的生物合成机制，旨在为新型graspetide类天然产物的研发提供思路借鉴。

关键词：graspetide类核糖体合成和翻译后修饰肽；微生物天然产物，生物合成，大环化

中图分类号：R915

Research progress on graspetide-like ribosomally synthesized and post-translationally modification peptide kind natural products

Lin Sixing, YU Yi, Zhang Qian

(Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (Ministry of Education),School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072)

Abstract: Microbial natural products are rich source of antibiotics. Modifying biosynthetic pathways of natural products to develop derivatives with excellent pharmacological activity has always been the important strategy to combat the antimicrobial resistance. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) consist of a large class of microbial natural products with potential antibiotic activity. The post-modification enzymes involved in the biosynthesis of RiPPs have broader substrate selection than non-ribosomal peptides and polyketide synthases, making RiPPs a group of natural products with greater engineering potential. More than 30 types of RiPPs have been discovered so far, which exhibit various biological activities such as antibacterial and antitumor. Graspetides are a kind of macrocyclization-modified RiPPs. This structural feature endows grapetides with good membrane permeability and stability, making them very advantageous in drug development. Graspetides can be divided into more than 24 groups according to the conserved sequence of their precursor peptides and the category of post-modification enzymes, implying that their biological assembly logic is complex and changeable. This review summarizes the biosynthetic mechanisms of representative graspetides newly discovered in recent years, aiming to provide ideas for the development of new graspetide-like natural products.

Key words: Graspetide-like RiPPs; Microbial natural products; Biosynthesis; Macrocyclization

引言

抗生素在临床上的广泛使用被誉为20世纪最伟大的医学突破[1]，然而，由于滥用抗生素而导致的耐药菌增多，人类的健康始终受到严重的威胁，研发可供替代的新型抗生素迫在眉睫[2]。目前临床上所使用的抗生素大多来源于微生物的小分子代谢物 [3-5]。这些微生物天然产物中，许多是来自于聚酮合酶（PKS）家族或非核糖体肽合成酶家族（NRPS）的，包括广泛使用的β-内酰胺类，四环素类，大环内酯类和糖肽类抗生素等[6-7]。然而，PKS和NRPS的生物合成酶在进行模块化组装时对底物的专一性较强，这也导致对PKS和NRPS进行工程化改造以产生具有药理活性的新型衍生物较为困难。

核糖体合成翻译后修饰肽（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides，RiPP）作为一类近二十年来才被广泛研究的微生物天然产物，由于其良好的潜在抗生素活性，引起了众多科研工作者们的关注[8]。参与RiPP类化合物生物合成过程的酶具有更好的底物宽泛性，相比于PKS以及NRPS类化合物，RiPP类化合物的的生物合成可塑性更大。至今，已有多项研究有效的改善了RiPP类化合物溶解度较低以及生物利用度较差等问题[9]，RiPP类化合物的临床应用前景十分广阔。目前，获得RiPP类化合物的手段大多来自于对其产生菌发酵液的提取分离，而通过化学合成的方式获得该类化合物依旧十分困难。因此，对于其生物合成机制的研究十分必要，这将助力新型RiPP类化合物的绿色生物“智造”。

RiPP类天然产物的生物合成机制

编码合成RiPP 的生物合成基因簇一般包含前体肽（Precursor Peptide）的编码基因和翻译后修饰酶的编码基因，有些基因簇中还包含可对发生翻译后修饰的前体肽进行酶切的肽酶的编码基因。前体肽通常由N端的前导肽（Leader Peptide）和C端的核心肽（Core peptide）组成，前导肽负责翻译后修饰作用的激活，识别，并确保翻译后修饰步骤以一定顺序进行；核心肽经翻译后修饰并由肽酶切割形成最终具有生物活性的RiPP（图1）[10]。RiPP 的生物合成基因簇编码的后修饰酶介导了种类多样的翻译后修饰，如Thioamitides中的硫代酰胺化[11]，Lanthipeptides等中在丝氨酸与苏氨酸上发生的脱水化[12-13]，Anacyclamide中半胱氨酸，苏氨酸或丝氨酸发生的杂环化等[14]，这些独特的翻译后修饰赋予了RiPP类天然产物超出核心肽氨基酸序列的多样性。

图1 RiPP生物合成示意图[10]

Figure1 Generic representation of RiPP biosynthesis[10]

至今，已有超过三十类具有不同翻译后修饰模式的RiPP类化合物被鉴定。其中， grasptide类RiPP化合物呈现标志性的大环化结构，其膜渗透性好，水解稳定性强[15]，在药物开发中具有显著优势，本文将对此类化合物进行详细综述。

以Microviridin为代表的graspetide类RiPPs的生物合成

ATP-grasp类修饰是由ATP-grasp类酶所介导的，在ATP的存在下使前体肽形成大环化结构的一种翻译后修饰。其修饰过程为：核心肽中特定的谷氨酸或天冬氨酸的侧链羧基被ATP分子磷酸化，随后，苏氨酸或丝氨酸的侧链羟基或赖氨酸的侧链氨基进攻磷酸化的羧基，形成氨基酸侧链间酯键或酰胺键并脱去一分子的水。

第一个被发现具有ATP-grasp类修饰的RiPP类天然产物是1990年从微囊藻中分离得到的Microviridin A[16]。在过去的20年里，多达十余种Microviridin A的类似物已得到了分离鉴定，它们的前体肽中都具有非常保守的PFFARFL前导肽基序与TxKxPSD核心肽基序，因此，它们的后修饰识别的模式以及发生后修饰的位点都较为接近。这些Microviridin类化合物能够抑制包括弹性蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶和胰凝乳蛋白酶以及酪氨酸酶在内的几种丝氨酸蛋白酶的水解活性[17-19]。在这些Microviridins中，Microviridin B的生物合成机制已得到了较为深入的研究。编码合成Microviridin B的基因簇包含前体肽的编码基因mdnA，两个ATP-grasp类修饰酶的编码基因mdnB和mdnC， 一个GNAT家族的 N-乙酰转移酶的编码基因mdnD[20]和一个ABC转运体的编码基因mdnE。前体肽MdnA碳端的氨基酸序列FGTTLKYPSDWEEY与Microviridin B的骨架完全吻合，异源表达实验表明MdnA的核心肽在MdnB和MdnC的修饰下发生环化，形成三元环状结构（图2），MdnD使环化的核心区域的N端发生乙酰化修饰，随后，在ABC转运体MdnE的作用下，成熟的核心区域即Microviridin B被切下并转运至胞外。

图2 Microviridin B生物合成中的ATP-grasp类后修饰

Figure 2 ATP-grasp like post-modification in the biosynthesis of Microviridin B

在2017年和2019年，非Microviridin类的具有ATP-grasp类修饰的RiPP，plesiocins[21]以及thuringinins[22]，分别被成功异源表达。Plesiocins及其类似物的前体肽中都具有保守的四个重复的TTxxxxEE的结构单元，每个重复单元的外侧Thr和Glu间以及内侧Thr和Glu间分别经ATP-grasp酶修饰形成酯键；thuringinins及其类似物的前体肽中都具有保守的三个重复的TxxTxxxExxD结构单元，每个重复单元的外侧Thr和Asp间以及内侧Thr和Glu间分别经ATP-grasp酶修饰形成酯键。此后，研究者们普遍以‘graspetide’来统称这类具有ATP-grasp类修饰的RiPP类天然产物。

随着生物信息学工具的发展以及graspetide化合物库的填充，近4000条编码graspetide类天然产物的基因簇得到了挖掘，它们广泛分布于酸杆菌门，放线菌门，拟杆菌属，绿湾菌门，蓝菌门，广古菌门，厚壁菌门，浮霉菌门，变形菌门等中[23]，依据前体肽编码基因的特征保守基序，这些基因簇被分为24组（group1-24），这也表明graspeptide类天然产物结构丰富且研究潜力较大。其中，除此前得到广泛研究的group1、2、3（分别为Microviridins，plesiocins，thuringinins的类似物）外，group4、5、6、7、11、16都于近期得到了代表性的化合物（图3），此外，近期还有两个具有新颖结构的Microviridin类似物以及一个具有新型特征序列的graspetide得到了鉴定。本文将对这些近期得到鉴定的代表性graspetide类天然产物作详细综述。

图3 代表性graspetides的核心肽序列以及发生ATP-grasp类后修饰的位点

Figure3 Core peptide sequence of the representative graspetides and the sites of ATP-grasp-like post-modification

新型graspetide类天然产物的研究进展

新型Microviridins类似物

此前所发现的Microviridin类似物都在核心肽的保守区域TxKxPSD及相邻的数个氨基酸残基处形成ATP-grasp类后修饰，且这些最终成熟的Microviridin的长度在12-20个氨基酸残基间。近期，两个在除了TxKxPSD及相邻氨基酸残基组成的核心区域之外形成了ATP-grasp类后修饰的新型Microviridin类似物chryseoviridin和chryseoviridin A2A得到了鉴定。

Chryseoviridin是由Chryseobacterium产生的一种新型Microviridins。Chryseoviridin的前导肽区域的特征氨基酸序列PFFAAFL与经典Microviridins的前导肽保守序列PFFARFL极为相似；其核心肽的特征氨基酸序列TLKYPSDSDE也与经典Microviridins的保守序列TxKYPSDxE相符，暗示其修饰模式可能与经典Microviridins类似。然而，Zhao[24]在其基因簇编码的ATP-grasp类后修饰酶CdnC对前体肽的体外测活实验中观察到前体肽的分子量减少了值为108 Da，因此该前体肽可能脱去了6分子水。经典Microviridins仅在核心肽TxKYPSDxE区域处形成2-3个氨基酸侧链间酯键或酰胺键，即仅脱去2-3分子的水，这也暗示着chryseoviridin可能在TxKYPSDxE区域之外还存在发生脱水修饰的氨基酸区域。他们通过分析氨基酸序列，推测了前体肽中发生脱水成环修饰的氨基酸区域，随后通过在其中插入TEV蛋白酶切割位点序列并对前体肽进行酶切，获得了脱去不同数量水分子的肽段，从而最终确定了chryseoviridin的修饰模式。与经典Microviridins所不同的是，除了核心肽中TxKYPSDxE保守区域的修饰，chryseoviridin在该区域的前端拥有四个相似的由5或6个氨基酸残基组成的重复单元，每个单元起始的苏氨酸与末端的天冬氨酸之间形成ω-酯键，重复单元之间由两个氨基酸残基所分隔（图4），chryseoviridin也成为第一个拥有重复结构单元的Microviridins类类似物。然而，本研究并没有对基因簇中另一个可能催化形成分子间酰胺键的ATP-grasp类后修饰酶CdnB的功能进行鉴定，因此该基因簇编码的天然产物的最终结构仍有待研究。与其它Microviridins类似，chryseoviridin也展现出对丝氨酸类蛋白酶的抑制作用，其对糜蛋白酶的抑制作用极强，IC50值为70 nM（其余Microviridins为100 nM至40μM）。

图4 chryseoviridin ATP-grasp类后修饰合成机制

Figure 4 Mechanism of the ATP-grasp-like post-modification in chryseoviridin

Chryseoviridin的发现引起了研究者对其产生菌Chryseobacterium所属的拟杆菌（Bacteroidetes）类中Microviridins亚型的研究兴趣。Wang[25]等对Chitinophagia japonensis DSM13484中编码合成Microviridins类天然产物的基因簇进行了研究。该基因簇中含有两个前体肽的编码基因chiA1和chiA2，chiA1基因的推测产物结构与此前发现的具有弹性蛋白酶抑制活性，但生物合成基因簇并未鉴定的环化多肽类化合物FR901451相同；chiA2的编码产物则尚未得到研究；该基因簇中还含有2个ATP-grasp类后修饰的编码基因chiB和chiC。通过体外酶活测试与质谱鉴定，ChiC催化ChiA1与ChiA2分别形成2个与3个分子间酯键；经过且仅当ChiC修饰后的ChiA1/ChiA2（mChiA1/mChiA2）可进一步与ChiB反应形成一个分子间酰胺键。与此同时，在大肠杆菌中共表达ChiA1、ChiA2、ChiB、ChiC也得到了相同的结果(图5)。与其它经典Microviridins不同的是，chiA1/ chiA2均具有PFFAQFL的前导肽识别序列，而非Microviridins类特征的前导肽序列PFFARFL。Chryseoviridin的发现也证明了Microviridins类前导肽的保守序列可扩展至PFFAxFL。此外，ChiA1的成熟修饰产物FR901451中C末端的氨基酸残基罕见的被切除了。作者通过进一步设计实验，表达得到了切除核心肽部分后的四个后随氨基酸的ChiA1/ChiA2并与ChiC/ChiB反应，同样观察到了脱水成环，证明了由ATP-grasp类后修饰酶介导的环化修饰过程并不受C-末端后随肽影响。

图5 chitinoviridinA1与A2A的ATP-grasp类后修饰合成机制

Figure5 Mechanism of the ATP-grasp-like post-modification in chitinoviridinA1 and A2A

由双功能ATP-grasp后修饰酶形成的marinomonasin

来自Marinomonas fungiae的graspetide基因簇编码产物为group7类的graspeptide，近期在大肠杆菌中被成功异源表达。Issara[26]等将该基因簇中前体肽的编码基因marA， ATP-grasp类后修饰酶的marB，可能参与合成的一个相邻但未知功能的酶CUB04734.1编码基因以及一个相邻的喹啉单加氧酶CUB04736.1编码基因构建至pET41a载体上并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达，结果显示，仅构建了marA与marB的表达菌就足以产生修饰后的产物marinomonasin。与许多RiPPs基因簇类似，marinomonasin基因簇也不包含编码在翻译后修饰作用完成后切除前导肽序列的肽酶，然而在marinomonasin的异源表达宿主菌即大肠杆菌中含有的宿主内源性的蛋白酶完成了这一过程。在其余的graspetides的生物合成中，其结构中由后修饰形成的分子间酰胺键与分子间酯键是由不同的ATP-grasp类后修饰酶引入的，而marinomonasin生物合成中的MarB既可以催化形成分子间酯键，也可以催化形成分子间酰胺键。Marinomonasin的发现阐明了其所代表的group7类graspetide的成环模式:外侧保守苏氨酸与天冬氨酸间成酯键，中间与内侧的保守赖氨酸与谷氨酸间分别形成酰胺键结构(图6)。

图6 marinomonasin的ATP-grasp类后修饰合成机制

Figure6 Mechanism of the ATP-grasp-like post-modification in marinomonasin

链霉菌来源的prunipeptin

编码合成group11的graspeptides生物合成基因簇有534条，主要分布在放线菌尤其是链霉菌中。在链霉菌中，这一类graspeptide的序列相似性非常高，其前导肽的保守序列为QPFALNYARPA, 核心肽保守序列为GTTTSTAGSKTHFDD。Unno[27]等将Streptomyces prunicolor中的编码合成此类graspetide的基因簇在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了异源表达。质谱结果显示，其编码产物prunipeptin的核心结构序列为ELGTTTSTAGSKTHFDD。随后，他们将prunipeptin前体肽中可能经翻译后修饰形成酯键或酰胺键的氨基酸突变为丙氨酸。在大肠杆菌中表达prunipeptin前体肽的S7A、K12A、D16A和D17A突变均无法产生prunipeptin的衍生物，其原因为未被完全修饰的prunipeptin核心肽无法被大肠杆菌中内源性的蛋白酶所识别，因此这四个氨基酸极可能为ATP-grasp类后修饰酶PruB的修饰位点。由于环状多肽无法提供详尽的二级碎片峰，为进一步验证该推测，他们使用色氨酸替换第15位的组氨酸，得到了prunipeptin 15HW，随后使用BNPS-skatole使色氨酸C端的肽键断裂从而使经后修饰环化的prunipeptin 15HW重新线性化，并通过二级质谱确认了prunipeptin的成环模式：PruB催化PruA的第7位丝氨酸与第17位天冬氨酸间成脱水成酯键，第12位赖氨酸与第16位天冬氨酸间脱水成酰胺键（图7）。

图7 prunipeptin的ATP-grasp类后修饰合成机制

Figure7 Mechanism of the ATP-grasp-like post-modification in prunipeptin

形成交错环结构的thatisin

Ramesh[23]等尝试表达了来自Lysobacter antibioticus ATCC 29479中的属于group16的graspeptides生物合成基因簇。该基因簇由编码前体肽的基因thtA，编码ATP-grasp-ligase的基因thtB，编码含肽酶的ATP结合转运蛋白（peptidase-containing ATP-binding transporter，PCAT）基因thtC和编码HlyD类分泌蛋白基因thtD组成。通过在大肠杆菌中共表达ThtA与ThtB，在质谱中可检测到分子量减少了36 Da的修饰后的前体肽。经过二级质谱结合点突变实验，ThtA以一个交错的模式，即核心肽区域的5位苏氨酸与13位天冬氨酸，8位苏氨酸与17位天冬氨酸间分别成环（图8）。

图8 thatisin的ATP-grasp类后修饰合成机制

Figure8 Mechanism of the ATP-grasp-like post-modification in thatisin

具有特殊内酰胺结构的fuscimiditide

Hader[28]等表达了来自嗜热放线菌Thermobifida fusca中的graspetide基因簇,其编码合成的产物为fuscimiditide。该基因簇由前体肽的编码基因thfA， ATP-grasp类后修饰酶的编码基因thfB和一个编码氧甲基转移酶的编码基因thfM组成。在大肠肝菌中共表达ThfA与ThfB的主要产物为发生了双脱水修饰（-36 Da）的前体肽，而共表达ThfA与ThfM则并不产生任何修饰。当ThfA，ThfB与ThfC共表达时，主要的产物为发生了三脱水修饰的前体肽（-48 Da），也有少量甲基化的发生双脱水修饰后的前体肽 (-22 Da)，暗示ThfM可能通过形成甲基化的前体肽中间体而额外的引入一个脱水修饰。点突变与NMR结果证明，ThfB在ThfA的核心肽的3号苏氨酸与22号天冬氨酸间，7号苏氨酸与18号天冬氨酸间引入了侧链间酯键，ThfM使ThfA核心肽的10号天冬氨酸与11号甘氨酸之间形成了内酰胺环（图9），其机理可能是天冬氨酸的侧链羧基在ThfM与SAM的存在下形成甲酯结构，该结构自发与相邻甘氨酸形成内酰胺结构并脱去一份子甲醇。Fuscimiditide的特征结构与此前由Sangeetha等发现的24组graspetides都不相同，然而将ThfA在NCBI中进行比对可以发现约50个与其相似的前体肽编码基因，且这些前体肽所属基因簇中均含有ATP-grasp类后修饰酶和氧甲基转移酶。因此，fuscimiditide代表着一组具有新型特征结构的graspeptides。

图9 fuscimiditide生物合成的后修饰机制

Figure9 The biosynthesis mechanism of fuscimiditide

结论

自Microviridins于1990年从微囊藻中被分离得到，这类具有独特ATP-grasp类大环化修饰的RiPPs就以惊人的速度发展。随着各种生物信息学工具的不断完善，大量的具有该类修饰的graspetide基因簇被分组鉴定得到，但其中许多组graspetide的代表性产物的生物学活性依旧未被鉴定。Graspetides展现出极大的结构多样性与药物研发潜力，而本文综述了今年来代表性的graspetides的鉴定过程与结构，对于未来对于这类RiPP天然产物数据库的填充提供了思路，为挖掘新型RiPP类抗菌药物提供了启发。

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作者简介：林思行（1997），男，硕士研究生，主要研究方向是微生物天然产物的生物合成

通信联系人：张倩（1994），女，助理研究员，主要研究方向是天然产物生物合成. E-mail: qianz@whu.edu.cn