一株产黄曲霉毒素B1的霉菌的分离鉴定及其产毒能力的研究 #

金蓓蓓，韩业慧，徐岩，穆晓清**

（江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122）

2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122;Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122;Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122;Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122;江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122;江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122;江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122214122;;;21412218762671285;;;1396172075618762671285;;;051085918201江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院7楼;;;江苏省无锡市江南大学生物工程学院1273081102@qq.com;105141922@qq.com;yxu@jiangnan.edu.cn;xqmuf@163.com金蓓蓓（1992-），女，硕士研究生，主要研究方向：酿酒工程与食品生物技术;;;穆晓清（1970-），男，副教授，主要研究方向：发酵工程金蓓蓓;韩业慧;徐岩;穆晓清JIN Beibei;HAN Yehui;XU Yan;MU Xiaoqing穆晓清国家自然科学基金（No.31530055）2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.01*|*期刊*|*Cavaliere A L, Caruso G, Cavaliere C, et al. Multiclass analysis in food,environmental and biological matrices with chromatography/mass spectrometry[J].Mass Spectrometry Review, 2012, (31): 466-502. <CR>2*|*学位论文*|*杜元正. 啤酒酿造过程中黄曲霉毒素B1的初步研究[D]. 无锡：江南大学，2012.<CR>3*|*期刊*|*Richard J L. Some major mycotoxins and their mycotoxicoses-an overview[J]. International Journal of Food Microbiol, 2007, 119(1-2): 3-10.<CR>4*|*期刊*|*Imperato R, Campone L, Piccinelli A L, et al. Survey of aflatoxins and ochratoxin a contamination in food products imported in Italy[J]. Food Control, 2011, 22(12): 1095-1910.<CR>5*|*期刊*|*Bennett J W, Klich M. Mycotoxins[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2003, 6(16): 497-516.<CR>6*|*学位论文*|*陈笔. 酱香型白酒酿造过程中霉菌群落结构以及酵母相互作用的研究[D]. 无锡：江南大学，2014.<CR>7*|*期刊*|*李觅，邓杰，杨跃寰，卫春国，黄治国，罗惠波，叶光斌，杨晓东，黄志瑜. 真菌毒素在浓香型白酒生产过程中的安全性检测[J]. 中国酿造，2015，(4）：129-133.<CR>8*|*期刊*|*杨晓东，罗惠波，叶光斌，李丹宇，王彩虹，王毅. 酶联免疫法验证黄曲霉毒素B1在浓香型白酒生产中的安全性[J]. 酿酒科技，2013，（4）：50-52.<CR>9*|*学位论文*|*韩现文. 三种真菌毒素分析方法的建立及其在白酒生产中的应用[D]. 天津：天津科技大学，2014.<CR>10*|*期刊*|*罗惠波，杨晓东，李丹宇，叶光斌，王毅. 中高温大曲中黄曲霉的分离鉴定及其安全性初步研究[J]. 酿酒科技，2012，（4）：37-40.<CR>11*|*期刊*|*Nagatomi Y, Inoue T, Uyama A, et al. The fate of mycotoxins during the distillation process of barely shochu,a distilled alcoholic beverage[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2012, 76(1): 202-204.<CR>12*|*期刊*|*Massi F P, Vieira M L, Sartori D, et al. Brazil nuts are subject to infection with B and G aflatoxin-producing fungus,Aspergillus pseudonomius[J]. International Journal of Food Microbiol, 2014, (186): 14-21.<CR>13*|*技术报告*|*张健，王小霞，张颖，等. 一株产赭曲霉毒素A黑曲霉的筛选与鉴定[R]. 天津：天津科技大学，2015.<CR>14*|*期刊*|*Garcia D, Ramos A J, Sanchis V, et al. Modeling the effect of temperature and water activity in the growth boundaries of Aspergillus ochraceus and Aspergillus parasiticus[J]. Food Microbiol, 2011, 28(3): 406-417.<CR>15*|*专著*|*齐祖同. 中国真菌志[M]. 北京：科学出版社，1997.<CR>16*|*期刊*|*张宏海，汪洋，张晓琳，等. 一株产赭曲霉毒素A黑曲霉及其产毒条件[J]. 菌物学报，2016，35（9）：1-11.<CR>17*|*专著*|*诸葛健，李华钟. 微生物学[M]. 北京：科学出版社，2009.<CR>18*|*学位论文*|*许艳丽. 产黄曲霉毒素菌株的检测方法及产毒条件的研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2008.<CR>19*|*期刊*|*Antonia M S, Filomena E, Panzarini G, et al. Effect of temperature and water activity on gene expression and aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus on almond medium[J]. International Journal of Food Micobiology, 2015, (217): 162-169.<CR>20*|*期刊*|*Iheanacho H E, Dutton M F, Steenkamp P A, et al. Real time PCR of Nor-1 (aflD) gene of aflatoxin producing fungi and its correlative quantization to aflatoxin levels in South African compound feeds[J]. Journal of Microbiol Methods, 2014, (97): 63-67.<CR>21*|*期刊*|*Gherbawy Y A, Shebany Y M, Hussein M A, et al. Molecular detection of mycobiota and aflatoxin contamination of chilli[J]. Archives of Biological Sciences, 2015, 67(1): 223-234.一株产黄曲霉毒素B1的霉菌的分离鉴定及其产毒能力的研究|Screening and identification of a aflatoxin B1 producing strain and its toxin-producing ability|国家自然科学基金（No.31530055）|1|金蓓蓓|JIN Beibei|江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122|Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122|金蓓蓓（1992-），女，硕士研究生，主要研究方向：酿酒工程与食品生物技术|江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学生物工程学院7楼|214122|1273081102@qq.com|18762671285|18762671285<CR>|2|韩业慧|HAN Yehui|江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122|Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122||||105141922@qq.com||<CR>|3|徐岩|XU Yan|江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122|Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122||||yxu@jiangnan.edu.cn||<CR>*|4|穆晓清|MU Xiaoqing|江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，无锡 214122|Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122|穆晓清（1970-），男，副教授，主要研究方向：发酵工程|江苏省无锡市江南大学生物工程学院|214122|xqmuf@163.com|051085918201|13961720756

摘要：本研究利用CA、YES培养基从42个白酒生产体系样品中共分离出76株霉菌，利用超高效液相色谱-质谱联用检测分析确定其中一株菌株G1具有产黄曲霉毒素B1(AFB1)的能力，该菌株来源于白酒存储环境样品。依据G1菌落形态、菌丝和分生孢子形态、ITS、β-Tubulin、 Calmodulin基因序列的系统发育树分析，鉴定该菌株为Aspergillus flavus。进一步研究了环境因素对G1菌株菌落生长和菌株产毒能力的影响。结果表明培养温度和水活度是影响其产毒能力的主要因素。

关键词：黄曲霉毒素B1；黄曲霉菌；菌种鉴定；产毒能力

中图分类号：Q93

Screening and identification of a aflatoxin B1 producing strain and its toxin-producing ability

JIN Beibei, HAN Yehui, XU Yan, MU Xiaoqing

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122)

Abstract: 42 samples of Chinese liquor production were cultivated on CA and YES media, and screened using the high performance liquid chromatography couple with mass spectrometry (UPLC-MS/MS). One strain which could produce AFB1 was isolated from Chinens liquor storage environment and named as G1. The target strain was identified by the morphological characteristics as well as nucleotide sequence analysis of ITS, β-Tubulin gene and Calmodulin gene, Strain G1 was identified as Aspergillus flavus. The effects of temperature, pH and water activity on the colony morphology and the AFB1 production were studied.The results indicated that temperature and water activity were the main factors influencing AFB1 production of strain G1.

Key words: Aflatoxin B1; Aspergillus flavus; identification; toxin-producing ability

引言

黄曲霉毒素(aflatxoins)，属于真菌毒素。稻谷[1]，玉米，发酵酒等制品[2,3]中经常发现黄曲霉毒素的存在。其中黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前发现的黄曲霉毒素中毒性最强、研究最广泛的一种真菌毒素，其危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。1993年黄曲霉毒素B1被世界卫生组织的癌症研究机构划定为“第一类致癌物”[4]。黄曲霉毒素主要由黄曲霉、寄生曲霉和集峰曲霉等霉菌产生[3, 5]。

白酒具有开放式发酵、自然接种的特点，白酒生产体系中存在各种各样的霉菌[6]，因此存在黄曲霉毒素及产毒微生物带入成品酒的风险[7]。杨晓东[8]、李觅[7]等采用酶联免疫法检测了浓香型大曲、入窖酒醅、丢糟、黄水、基酒、成品酒样品中黄曲霉毒素B1含量。结果表明，所有样品中黄曲霉毒素B1含量均低于2.6μg/L，其中基酒和成品酒中黄曲霉毒素B1含量远低于方法检出限。韩现文[9]等采用HPLC-FL法检测了芝麻香白酒原料（高梁）、大曲、酒醅、黄水、原酒、成品酒中黄曲霉毒素B1含量。结果表明，所有样品中仅有一份白酒大曲样品中检出黄曲霉毒素B1 (1.04μg/L)。然而目前对于白酒中黄曲霉毒素的研究多集中于定量方法的建立，对于白酒生产体系中具有产毒能力的微生物的研究较少[10]。

本研究从白酒存储环境中筛选分离出一株具有产黄曲霉毒素B1能力的菌株。通过传统形态学分类特征和基因系统发育分析对该菌株进行了种属鉴定，同时研究了影响其产毒能力的环境因素，从而为白酒生产过程及存储过程中规避黄曲霉菌产毒风险提供理论依据。

材料与方法

材料与仪器

样品来源

白酒大曲样品共34份，酒醅样品共6份，白酒存储环境样品共2份，取样自全国各酒厂。

培养基

察氏（CA）培养基，酵母浸膏蔗糖（YES）培养基。

主要试剂

蔗糖、琼脂、乙醇、及培养基试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；PCR试剂购自生物工程（大连）有限公司；黄曲霉毒素混标购于美国Sigma公司；质谱级甲醇乙腈购于美国Fisher公司。

主要仪器

超高效液相色谱-质谱联用仪（美国waters公司）；高速离心机（美国Eppendorf公司）；Milli-Q超纯水机（美国密理博公司）；电镜（日本日立公司）；高压蒸汽5S-325全自动灭菌锅（Tomy公司）；PCR仪（德国Eppendorf公司）；凝胶成像仪（美国Protein Simple公司）；细胞破碎仪 FastPrep H-24（美国MP-biomedicals公司）；水份活度测定仪Labswift-aW（瑞士NOVASINA公司）。

霉菌菌株的筛选

取10g固体样品于250mL三角瓶中，加入90mL生理盐水，200 r/min震荡1h，取上清液为10-1的稀释样。然后逐级梯度稀释至10-2，10-3，10-4，10-5稀释样。分别取100μL均匀涂布于CA培养基中，30℃静置培养2-3d观察，其中储存环境样品为孢子采用直接划线分离的方式进行培养。挑取霉菌单菌落于CA培养基中划线培养，直至筛选出霉菌单菌落。

产黄曲霉毒素能力的确定

孢子悬液的制备

将菌株在查氏琼脂培养基上培养（25℃，7d）后制备孢子悬浮液，以无菌生理盐水将孢子洗下，所得悬液以玻璃珠打散后经8层消毒纱布过滤，收集滤液并用血球计数板计数，使用无菌水调整孢子悬浮液至107CFU /mL。

黄曲霉毒素B1的提取

将上述孢子悬浮液接种于YES培养基中，30℃静置培养5d。用打孔器从菌落中心到外沿依次取直径为9mm的3块带有菌丝体的培养物放入50mL离心管中，加入20ml甲醇，25℃、200r/min震荡1h，8000r/min离心10min后，取上清液过0.22μL滤膜，UPLC-MS/MS进行检测鉴定黄曲霉毒素。

黄曲霉毒素B1的检测：

UPLC色谱条件为：采用ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7μm, 10mm）；以0.01%甲酸为流动相A相，以100%甲醇为流动相B相，流速为0.5mL/min；梯度洗脱方式进行洗脱，洗脱程序如下：0.00min，5%流动相B；7.00min，60%流动相B；9.00min，100%流动相B；11.00 min，100%流动相B。质谱条件为[11]：离子源为电喷雾离子化源（ESI）；喷雾电压为3000V（+）；离子源温度为150℃，去溶剂温度为300℃。

菌株的鉴定

形态学鉴定

将分离到的菌株采用CA、YES平板培养后，采用光学显微镜及扫描电镜对菌落、菌丝和孢子等结构进行观察，并参照《中国真菌志》进行鉴定。

分子生物学鉴定

从培养好的新鲜菌体里提取菌株DNA，以菌株的基因组DNA为模板，分别采用ITS、β-Tubulin和Calmodulin引物对其进行PCR扩增，采用的反应体系为：ITS：94℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 10min。β-Tubulin和Calmodulin：95℃ 60s；95℃ 20s；50℃ 15s；60℃ 1.5min；30个循环；60℃ 1.5min。PCR 扩增的目标产物送至上海生工测序公司测序。

系统发育分析

将测序得到的ITS、β-Tubulin和Calmodulin序列在NCBI中使用BLAST比对后申请GenBank登录号。使用MEGA6.0软件ClustalW方法进行聚类分析，以Neighbour-Joining法构建分子系统发育树，在分支上标记1000次重复获得的自展检验 Bootstrap值评估系统发育树的置信度，从而确定各菌株的亲缘关系及分类地[12,13]。

温度对菌落生长及产毒能力的影响

将 1μL 孢子悬液接种于YES 琼脂培养基中央，分别在 20、25、30、37、45℃条件下培养5d，测量菌落直径，并以按1.3的方法测定菌株产AFB1的量。试验设置3组平行。

pH对菌落生长及产毒能力的影响

调节YES 琼脂培养基pH至4.94、6.06、7.10、8.96、9.96、10.88将1μL孢子悬浮液接种于培养基中央，在30℃条件下培养5d，测量菌落直径，并按1.3的方法测定菌株产AFB1的量。试验设置3组平行。

水活度对菌落生长及产毒能力的影响

通过在培养基中加入不同浓度50、150、250、350、450、600g/L的甘油调节培养基水活度[14]至0.926、0.902、0.884、0.859、0.841、0.809，将1μL孢子悬浮液接种于YES琼脂培养基中央，在30℃条件下培养5d，测量菌落直径，并按1.3的方法测定菌株产AFB1的量。试验设置3组平行。

结果与讨论

产黄曲霉毒素菌株的筛选

以不同地区白酒生产体系中的样品作为分离筛选对象，分别从大曲样品（34份）中分离出56株霉菌，酒醅样品（6份）中分离出11株霉菌，白酒存储环境样品（2份）中分离出9株霉菌。最终仅从白酒存储环境中分离出一株具有产黄曲霉毒素B1的能力的菌株，并将该菌株编号为G1。

G1菌株形状特征研究

G1在CA平板表面25℃培养7d的菌落直径在60-65mm之间，整体呈淡黄色，外围有一圈白色菌丝，中间颜色最深为浅黄色孢子。G1在YES平板表面25℃培养7d的菌落直径在78-80mm之间，整体呈黄绿色，外围有一圈白色菌丝，菌落表面有大量菌丝体并带有黄绿色孢子。菌株的电镜特征见图1C-D，分生孢子梗表面粗糙，分生孢子在小梗上呈链状着生，呈放射性排列[15]。

图1 G1在CA和YES培养基上菌落及微观形态

Fig. 1 The colonies morphology and micromorphologies of strain G1 cultured on CA and YES medium

注：A、B、C、D分别为G1菌株在CA培养基上培养7d、G1菌株在YES培养基上培养7d、菌株在电镜下微观形态(160×)、菌株在电镜下微观形态(1500×)

Note: A stand for the colony morphology of G1 on CA medium, B stand for the colony morphology of G1 on YES medium, C stand for electron microscope (160×) of G1 on CA medium , D stand for electron microscope (1500×) of G1 on CA medium.

ITS、β-Tubulin 和 Calmodulin 的序列登录号及系统发育分析

在NCBI中通过BLAST程序与已有的核酸序列进行比对后，以Neighbour-Joining法构建ITS、β-Tubulin和Calmodulin序列的系统发育树[16]，3个系统发育树共同表明G1菌株与黄曲霉有较高的同源性，结合形态学分析将G1菌株鉴定为黄曲霉，实验室将其命名为Aspergillus flavus G1（图2-图4）。

图2 G1菌株基于ITS DNA序列的系统发育树

Fig. 2 Phylogenic tree of ITS DNA sequence in strain G1

图3 G1菌株基于β-Tubulin DNA 序列的系统发育树

Fig. 3 Phylogenic tree of β-Tubulin DNA sequence in strain G1

图4 G1菌株基于 Calmodulin DNA 序列的系统发育树

Fig. 4 Phylogenic tree of Calmodulin DNA sequence in strain G1.

温度对菌株菌落生长及菌株产毒能力的影响

温度是影响微生物生长和生存的最重要的环境因素之一。温度通过影响微生物细胞膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成和活性、RNA结构及转录等影响微生物的生命活动[17]。针对黄曲霉菌株G1，在20℃~45℃的范围考察了培养温度对发酵产毒素过程的影响。1μL的107 CFU /mL孢子悬浮液接种于YES培养基中培养5d后，分别测定菌落直径及黄曲霉毒素B1含量，结果如图5所示。

图5 温度对G1菌株在YES上菌落生长和AFB1产量的影响

Fig. 5 Effect of temperature on colony and aflatoxin B1 production of Aspergillus flavus G1 strain on YES medium

当培养温度≤30℃时，菌落直径随温度升高而增大，菌株产毒的量与菌落直径成正相关关系，产毒量在30℃时达到最大值；当培养温度在37℃时，菌落直径达到最大值，但产毒量较30℃培养条件下急剧减少；菌株培养温度达到45℃条件下菌落基本不生长，无毒素产生。可以发现温度较高或偏低时黄曲霉毒素的合成均受到影响。

pH对菌落生长及产毒能力的影响

培养基或环境中的pH值与微生物的生命有着密切的联系，微生物生长都有其最适pH范围，其中霉菌适合于pH在5-6的酸性环境[17]。在培养基pH为4.94、6.06、7.10、8.96、9.96、10.88的不同条件下，将1μL的107 CFU /mL孢子悬浮液接种于YES培养基中培养5d后，分别测定黄曲霉菌G1菌落直径及黄曲霉毒素B1含量，结果如图6所示。

图6 pH对G1菌株在YES上菌落生长和AFB1产量的影响

Fig. 6 Effect of pH on colony and aflatoxin B1 production of Aspergillus flavus G1 strain on YES medium

当YES培养基的pH在5-6时，菌落直径随pH升高而增大，菌落产毒的量与菌落直径呈正相关，并在pH为6时达到最大值；但当pH大于6时，菌落直径及菌落产毒的量均随pH的升高而减小。由图6可看出，G1菌株代谢产毒能力在pH5-6时最强，当培养条件偏碱性时，黄曲霉菌的生长和产黄曲霉毒素的能力都会受到抑制，这也可能与黄曲霉毒素在碱性环境中不稳定有关[18]。

水活度对菌落生长及产毒能力的影响

微生物的生命活动离不开水，这不仅因为水是细胞的重要组成成分，还因为它是一种起着溶剂和运输介质作用的物质[17]。不同微生物对水的需要是有差别的，主要表现为对环境或培养基的水活度要求不同。考察培养基水活度为0.82~0.93之间，以1μL的107 CFU /mL孢子悬浮液接种于YES培养基中培养5d后，分别测定菌落直径及黄曲霉毒素B1含量，结果如图7所示。

图7 aw对G1菌株在YES上菌落生长和AFB1产量的影响

Fig. 7 Effect of aw on colony and aflatoxin B1 production of Aspergillus flavus G1 strain on YES medium

G1菌株在培养基水活度小于0.85时，菌株不生长不代谢毒素。当培养基水活度大于0.85时，菌株开始正常生长，且菌落直径及产毒的量与培养基的水活度呈现正相关。当培养基水活度大于0.90时，菌株代谢毒素能力则呈现急剧增长的趋势。可见培养基水活度的大小是影响G1菌株生长和代谢产毒的重要因素。

结论

对于曲霉属菌株的鉴定，主要是通过形态学结合分子学的多相鉴定。这是由于曲霉属之间的形态学及生理生化差异不显著，且形态特征容易受到环境因素的影响，需要辅以ITS、Calmodulin和β-Tubulin等基因序列分析加以区分。本文以从白酒存储环境中分离出的一株具有产黄曲霉毒素能力的G1菌株为研究对象，基于形态特征和多基因序列分析，最终将G1菌株鉴定为Aspergillus flavus。

实验研究发现，G1菌株在适宜的条件下生长迅速，AFB1的产量受培养温度、培养基pH、培养基水活度等因素的影响，其中温度和水活度的影响最大。培养温度在30℃左右时，菌株产毒量达到最大值，当培养温度在37℃及以上则产黄曲霉毒素的能力会被完全抑制；水活度越高也越有利于真菌生长和毒素合成，水活度在0.90以下菌体的生长缓慢，产毒能力也较弱，当水活度小于0.85时，菌株基本不生长；水活度在0.90以上时，菌体生长迅速，产毒能力随着水活度升高而增强。有研究表明，不同培养条件下黄曲霉菌株代谢能力的不同是与基因aflD和aflO的表达相关[19-21]。

现有对于白酒体系中真菌毒素的研究多集中于定量检测[7, 9, 10]，产毒微生物的研究工作较少。本研究从42个白酒生产体系样品中分离得到一株具有产黄曲霉毒素B1能力的霉菌，并以液质联用法定量该黄曲霉菌产毒量能力。结果表明，白酒生产体系中产毒霉菌的出现属于偶发事件，白酒发酵过程中分离出的霉菌都不产黄曲霉毒素B1，仅从存储环境中分离出一株具有产毒能力的霉菌，但是白酒生产企业仍应当引起重视，确保白酒存储环境温度和湿度的控制。

[参考文献] (References)

[1] Cavaliere A L, Caruso G, Cavaliere C, et al. Multiclass analysis in food,environmental and biological matrices with chromatography/mass spectrometry[J].Mass Spectrometry Review, 2012, (31): 466-502.
[2] 杜元正. 啤酒酿造过程中黄曲霉毒素B1的初步研究[D]. 无锡：江南大学，2012.
[3] Richard J L. Some major mycotoxins and their mycotoxicoses-an overview[J]. International Journal of Food Microbiol, 2007, 119(1-2): 3-10.
[4] Imperato R, Campone L, Piccinelli A L, et al. Survey of aflatoxins and ochratoxin a contamination in food products imported in Italy[J]. Food Control, 2011, 22(12): 1095-1910.
[5] Bennett J W, Klich M. Mycotoxins[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2003, 6(16): 497-516.
[6] 陈笔. 酱香型白酒酿造过程中霉菌群落结构以及酵母相互作用的研究[D]. 无锡：江南大学，2014.
[7] 李觅，邓杰，杨跃寰，卫春国，黄治国，罗惠波，叶光斌，杨晓东，黄志瑜. 真菌毒素在浓香型白酒生产过程中的安全性检测[J]. 中国酿造，2015，(4）：129-133.
[8] 杨晓东，罗惠波，叶光斌，李丹宇，王彩虹，王毅. 酶联免疫法验证黄曲霉毒素B1在浓香型白酒生产中的安全性[J]. 酿酒科技，2013，（4）：50-52.
[9] 韩现文. 三种真菌毒素分析方法的建立及其在白酒生产中的应用[D]. 天津：天津科技大学，2014.
[10] 罗惠波，杨晓东，李丹宇，叶光斌，王毅. 中高温大曲中黄曲霉的分离鉴定及其安全性初步研究[J]. 酿酒科技，2012，（4）：37-40.
[11] Nagatomi Y, Inoue T, Uyama A, et al. The fate of mycotoxins during the distillation process of barely shochu,a distilled alcoholic beverage[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2012, 76(1): 202-204.
[12] Massi F P, Vieira M L, Sartori D, et al. Brazil nuts are subject to infection with B and G aflatoxin-producing fungus,Aspergillus pseudonomius[J]. International Journal of Food Microbiol, 2014, (186): 14-21.
[13] 张健，王小霞，张颖，等. 一株产赭曲霉毒素A黑曲霉的筛选与鉴定[R]. 天津：天津科技大学，2015.
[14] Garcia D, Ramos A J, Sanchis V, et al. Modeling the effect of temperature and water activity in the growth boundaries of Aspergillus ochraceus and Aspergillus parasiticus[J]. Food Microbiol, 2011, 28(3): 406-417.
[15] 齐祖同. 中国真菌志[M]. 北京：科学出版社，1997.
[16] 张宏海，汪洋，张晓琳，等. 一株产赭曲霉毒素A黑曲霉及其产毒条件[J]. 菌物学报，2016，35（9）：1-11.
[17] 诸葛健，李华钟. 微生物学[M]. 北京：科学出版社，2009.
[18] 许艳丽. 产黄曲霉毒素菌株的检测方法及产毒条件的研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2008.
[19] Antonia M S, Filomena E, Panzarini G, et al. Effect of temperature and water activity on gene expression and aflatoxin biosynthesis in Aspergillus flavus on almond medium[J]. International Journal of Food Micobiology, 2015, (217): 162-169.
[20] Iheanacho H E, Dutton M F, Steenkamp P A, et al. Real time PCR of Nor-1 (aflD) gene of aflatoxin producing fungi and its correlative quantization to aflatoxin levels in South African compound feeds[J]. Journal of Microbiol Methods, 2014, (97): 63-67.
[21] Gherbawy Y A, Shebany Y M, Hussein M A, et al. Molecular detection of mycobiota and aflatoxin contamination of chilli[J]. Archives of Biological Sciences, 2015, 67(1): 223-234.

基金项目：国家自然科学基金（No.31530055）

作者简介：金蓓蓓（1992-），女，硕士研究生，主要研究方向：酿酒工程与食品生物技术

通信联系人：穆晓清（1970-），男，副教授，主要研究方向：发酵工程. E-mail: xqmuf@163.com